Статьи, публикации и и.п.

Сборник студенческих научных работ. Выпуск II.- Москва: РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева, 2005. - С.404-408.

Локализация генов на хромосомах кур
(Gallus Gallus)

Студентка 4 курса А.А.Краснопеева

Научные руководители: проф. А.Ф.Смирнов (СПбГУ), доц. О.В.Кузнецова (МСХА)

В настоящее время активно изучается структурно-функциональная организация геномов многих видов животных, растений и микроорганизмов. Одним из подходов к исследованию этой проблемы является построение генетических и физических карт геномов, поиск гомологичных участков хромосом разных видов и сравнение локализации этих участков на хромосомах. Знание структурно-функциональной организации хромосом позволяет анализировать общие закономерности организации хромосом эукариотических клеток, выяснить особенности организации, обусловленные таксономическим положением вида, выявить внутригеномную гомологию и гомологию нуклеотидных последовательностей у разных видов, исследовать эволюцию геномов. Такие данные, в свою очередь, могут быть использованы для решения ряда практических проблем, связанных, например, с поиском генов-кандидатов, определяющих развитие количественных признаков или заболеваний у сельскохозяйственных животных. Исследования геномов птиц проводятся в основном на курах и перепелах, поскольку эти виды имеют важное сельскохозяйственное значение и удобны как лабораторный объект.

Работа выполнена в лаборатории генетики животных Биологического НИИ Санкт-Петербургского государственного университета.

Целью работы является локализация участков генома домашней курицы, гомологичных двум Not1-клонам NL1-290 и NL1-097, соответствующих Т-диску хромосомы 3 человека HSA3q13-23.

Сформулированы следующие задачи:
- установить методом гетерологичной двухцветной гибридизации ДНК-ДНК in situ совместно или раздельно локализуются на хромосомах домашней курицы фрагмент NL1-290 Т-диска HSA3q13-23 и специфичный для 14 хромосомы курицы BAC-клон JE014E08.
- установить методом гетерологичной двухцветной гибридизации ДНК-ДНК in situ совместно или раздельно локализуются на хромосомах домашней курицы фрагмент NL1-097 Т-диска HSA3q13-23 и специфичный для 15 хромосомы курицы BAC-клон JE020G17.

Методика. Трансформацию клеток E.coli BAC-клонами JE014E08 (специфичный для хромосомы 14 кур) и JE020G17 (специфичный для хромосомы 15 кур), выделение и очистку эписомной ДНК проводили по стандартным методикам (Маниатис и соавт., 1984). Мечение ДНК-зондов осуществлялось при помощи ник-трансляции с использованием нерадиоактивных дезоксинуклеотидтрифосфатов для этого использовались наборы реактивов «Ферментас» (Вильнюс, Литва) и biotin-11-dUTP (для Not1-клонов человека) и digixigenin-16-dUTP (BAC-клонов курицы). Преципитация ДНК-зондов и супрессия неспецифической гибридизации проведена в присутствии конкурирующей ДНК спермы сельди «Sigma». Гибридизацию in situ меченных ДНК-зондов с ДНК митотических хромосом проводили по стандартной методике (Licher at al., 1991) с некоторыми модификациями. Детекцию гибридных сигналов осуществляли с использованием флуоресцентных красителей при помощи авидин-FITC, антидигоксигенин-родамин и антидигоксигенин-Cy3 флуоресцентных систем детекции по общепринятой методике (Florijn et al., 1995) с некоторыми модификациями. Анализ результатов гибридизации проводили с использованием системы флуоресцентного микроскопа «Люмам» (увеличение об. 100х, ок. 10х), CCD-камеры «CHIPER» и компьютерной программы Ista Video Test-FISH.

Кариотип кур представлен 2n = 78 хромосомами, из которых 16 хорошо различимых макрохромосом и 62 микрохромосомы, не отличимые друг от друга в световой микроскоп (Bitgood and Somes, 1990). Различать микрохромосомы можно только методами молекулярной цитогенетики, используя специальные, специфичные для конкретной хромосомы маркеры.

Предыдущие исследования выявили, что клон NL1-097 локализуется совместно с BAC-клоном JE024F14, специфичным для 15 хромосомы курицы, а клон NL1-290 – совместно с BAC-клоном JE027C23, специфичным для хромосомы 14 курицы. Следовательно, можно предполагать, что участки генома домашней курицы, гомологичные клонам NL1-290 и NL1-097 хромосомы 3 человека, располагаются в микрохромосомах курицы 14 и 15 соответственно. Однако для точного и однозначного установления локализации исследуемых клонов на хромосомах курицы требуется анализ их совместной локализации с другими специфичными к хромосомам 14 и 15 курицы последовательностями.

Нами были взяты другие BAC-клоны - JE014E08 (специфичный для хромосомы 14) и JE020G17(специфичный для хромосомы 15). Характеристика использованных маркерных BAC-клонов приведена в табл.1. Характеристика Not1-клонов NL1-290 и NL1-097, локализацию которых требуется установить, приведена в табл. 2.

Результаты гибридизации представлены на рис.1 и 2. Метка, соответствующая Not1-клону из района 3q13-23 длинного плеча хромосомы 3 человека NL1-290, и метка, соответствующая специфичному для 14 хромосомы курицы BAC-клону JE014E08 выявляются на одной микрохромосоме (см. рис. 1). Таким образом, выявлена совместная локализация этого клона с двумя разными специфичными для 14 хромосомы курицы BAC-клонами - JE027C23 и JE014E08, содержащими кластер HBA. Следовательно, положение участка, ортологичного клону NL1-290 хромосомы 3 человека, на 14 хромосоме курицы можно считать доказанным. На рис.2 можно видеть, что метка, соответствующая NL1-097 клону из района 3q13-23 длинного плеча хромосомы 3 человека, обнаруживается на той же микрохромосоме, что и метка, соответствующая специфичному для 15 хромосомы курицы BAC-клону JE020G17. Следовательно, этот клон локализуется на одной микрохромосоме с двумя разными специфичными для 15 хромосомы курицы BAC-клонами JE024F14, содержащим ген IGVPS, и JE020G17, содержащим ген ALDH1. Таким образом, положение этого клона на 15 хромосоме курицы можно считать доказанным. Поскольку ранее было показано, что на одной хромосоме с клоном NL1-097 локализуются и клоны NL2-092, NL2-230, NLM-007, NLM-118, NLM-196, доказано расположение этих клонов на хромосоме 15 курицы.

Хочу поблагодарить моих руководителей: проф. А.Ф. Смирнова, доц. О.В. Кузнецову; коллектив лаборатории, с которым мне выпало счастье работать, и проф. Л.И. Хрусталеву (МСХА) за ценные консультации.

Библиографический список

1. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. – М.: Мир, 1984. – 479 с.

2. Bitgood J.J., Somes R.G. Linkage relationships and gene mapping // In: Poultry Breeding and Genetics (R.D. Crawford ed.). – Amsterdam: Elsevier, 1990. - P. 469-495.

3. Florijn R.J., Bonden L.A. Vrolijk H., Wiegant J., Vaandrager J.W., Baas F., den Dunnen J.T., Tanke H.J., van Ommen G.J., Raap A.K. High-resolution DNA Fiber-FISH for genomic DNA mapping and colour bar-coding of large genes // Hum. Mol. Genet. – 1995. Vol. 4. – P. 831-836.

4. Lichter P., Boyle A.L., Cremer T., Ward D.C. Analysis of genes and chromosomes by nonisotopic in situ hibridization // Genet. Anal. Tech. Appl. – 1991. – Vol. 8. – P. 24-35.