|
Готовиться к печати в сборнике студенческих научных работ. Выпуск III.- Москва: РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева, 2006.
Локализация клонов генома человека
на микрохромосомах перепела (Coturnix japonica)
Студентка 5 курса А.А.Краснопеева
Научные руководители: проф. А.Ф.Смирнов (СПбГУ), доц. О.В.Кузнецова (РГАУ - МСХА им. К.А. Тимирязева)
Работа выполнена в лаборатории генетики животных Биологического НИИ Санкт-Петербургского государственного университета.
В настоящее время активно изучается структурно-функциональная организация геномов многих видов животных, растений и микроорганизмов. Одним из подходов к исследованию этой проблемы является построение генетических и физических карт геномов,
поиск и сравнение локализации гомологичных участков хромосом разных видов. Знание структурно-функциональной организации хромосом позволяет анализировать общие закономерности организации хромосом эукариотических клеток, выяснить особенности
организации, обусловленные таксономическим положением вида, выявить внутригеномную гомологию и гомологию нуклеотидных последовательностей у разных видов, исследовать эволюцию геномов. Такие данные, в свою очередь, могут быть использованы
для решения ряда практических проблем, связанных, например, с поиском генов-кандидатов, определяющих развитие количественных признаков или заболеваний у сельскохозяйственных животных. Исследования геномов птиц проводятся в основном на
курах и перепелах, поскольку эти виды имеют важное сельскохозяйственное значение и удобны как лабораторный объект.
Кариотип перепела представлен 2n = 78 хромосомами, из которых 16 хорошо различимых макрохромосом и 62 микрохромосомы, неотличимые друг от друга в световой микроскоп. Различать микрохромосомы можно только методами молекулярной цитогенетики,
используя специальные специфичные для конкретной хромосомы маркеры.
Целью работы является локализация трех клонов хромосомы 3 человека из короткого плеча (Ap-2, NL3-012, NL3-015) и одного клона из длинного плеча (NL2-230) на хромосомах перепела.
Для этого решены следующие задачи:
Определение группы сцепления путем совместной гибридизации клонов с клонами известной локализации Идентификация хромосом путем совместной локализации клонов с хромосомоспецифическими последовательностями
Материалы. Оплодотворенные яйца перепела из частного хозяйства А. Л. Вахромеевой (Санкт-Петербург). Куриные ВАС-клоны E20B14 (GGA12), E27C23 (GGA14), E24F14 (GGA15) для идентификации хромосом перепела. Клоны предоставленны Дж.Б. Додсоном
и М.Н. Романовым (Университет штата Мичиган, США). Двадцать клонов плазмидных NotI - библиотеки, содержащие фрагменты ДНК из хромосомы 3 человека (районы 3p21 и 3q13-23) предоставленные Е. Р. Забаровским (Каролинский Институт, Стокгольм)
и Н. В. Воробьевой (Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск).
Методы. Препараты митотических хромосом готовились из 72-часовых эмбрионов перепела согласно общепринятой методике [1]. Мечение ДНК-зондов осуществлялось при помощи ник-трансляции с использованием нерадиоактивных дизоксинуклеотидтрифосфатов,
для этого использовали наборы реактивов «Ферментас» (Вильнюс, Литва) и biotin-11-dUTP и digoxigenin-16-dUTP. Преципитация ДНК-зондов и супрессия неспицифической гибридизации проведена в присутствии конкурирующей ДНК спермы сельди «Sigma».
Гибридизацию in situ меченных ДНК-зондов с ДНК митотических хромосом проводили по стандартной методике [2] с некоторыми модификациями. Детекцию гибридных сигналов осуществляли с использованием флуоресцентных красителей при помощи
авидин-FITC, антидигоксигенин-родамин и антидигоксигенин-Су3 флуоресцентных систем детекции по общепринятой методике [3] с некоторыми модификациями. Анализ результатов гибридизации проводили с использованием системы флуоресцентного микроскопа
«Люмам» (увеличение об.100х, ок.10х), CCD-камеры «CHIPER» и компьютерной программы Ista Video Test-FISH. Анализировали 14 гибридизаций по 30 метафазных пластинок для каждой.
Результаты и обсуждения. Предыдущие исследования выявили, что 16 клонов хромосомы 3 человека образуют 3 группы сцепления при гибридизации на хромосомах перепела. 10 клонов из p-плеча хромосомы 3 (Ap-32, NL1-210, NL1-212, NL1-232,
NL1-320, NL2-008, NL3-004, NLM-223, NLM-248, NRL-405) образуют одну группу сцепления, локализующуюся раздельно с двумя другими. Вторая и третья группы сцепления образованы клонами с q-плеча хромосомы 3 человека (NL1-290, NL2-092, NLM-118
и NL1-097, NLM-007, NLM-196 соответственно). Взаимное расположение этих двух групп неизвестно.
Чтобы определить группу сцепления для клонов из p-плеча были поставлены следующие гибридизации ДНК-ДНК in situ на хромосомах перепела: NL2-008( отнесен к первой группе сцепления) c NL3-015, NL3-015 c Ap-2, Ap-2 c NL3-012. Во всех трех
гибридизациях клоны гибридизуются совместно. Значит, 13 клонов из района HSA3p21 хромосомы 3 человека образуют одну группу сцепления.
Для определения группы сцепления клона NL2-230 из q-плеча хромосомы 3 человека, а также взаимное расположение второй и третьей групп сцепления были поставлены следующие гибридизации на хромосомах перепела: NL1-290 (2 группа сцепления)
c NL2-230, NL2-230 c NL2-092 (2-я группа), NL1-290 c NLM-196 (3-я группа). Изученные пары клонов гибридизуются совместно. Следовательно, вторая и третья группы сцепления и клон NL2-230 принадлежат одной хромосоме.
Для определения номера микрохромосом перепела, на которых локализуются установленные нами две группы сцепления, мы использовали 3 хромосомоспецифические последовательности для 12 (E20B14), 14 (E27C23) и 15 (E24F14) хромосом. Были
поставлены следующие гибридизации. С клонами из p-плеча хромосомы 3 человека:
Ap-2 c E20B14 – совместная
NL1-210 c E20B14 – совместная
NL1-212 c E27C23 – раздельная
NL1-212 c E24F14 – раздельные
С клонами из q-плеча хромосомы 3 человека:
NL1-290 c E27C23 – раздельная
NL1-290 c E24F14 – совместная
Это означает, что первая группа сцепления локализуется на хромосоме перепела, ортологичной 12-й хромосоме курицы, а вторая – на хромосоме перепела, ортологичной 15-й хромосоме курицы. Это также подтвердили совместные гибридизации всех клонов,
образующих первую группу сцепления с хромосомоспецифической последовательностью для 12-й хромосомы курицы и клонов, образующих вторую группу сцепления с хромосомоспецифической последовательностью для 15-й хромосомы курицы.
Выводы:
- NotI-клоны из района 3p21 хромосомы 3 человека (Ap-2, Ap-32, NL1-210, NL1-212, NL1-232, NL1-320, NL2-008, NL3-004, NL3-012, NL3-015, NLM-223, NLM-248, NRL-405) образуют одну группу сцепления и локализуются на хромосоме перепела, ортологичной
хромосоме 12 курицы.
- NotI-клоны из района 3q13-23 хромосомы 3 человека (NL1-290, NL1-097, NL2-092, NL2-230, NLM-007, NLM-118, NLM-196)также образуют одну группу сцепления и локализуются на хромосоме перепела, ортологичной хромосоме 15 курицы.
Хочу поблагодарить моих руководителей: проф. А.Ф. Смирнова, доц. О.В. Кузнецову; и коллектив лаборатории, с которым мне выпало счастье работать.
Список литературы:
[1] - Родионов А.В., Дукельская А.В., Кузнецова Т.В. Характер флуоресценции макрохромосом цыпленка, обработанных флуорохромом Хехст 33258 // Бюл. ВНИИГРЖ. 1981. Т. 51. С. 11-14.
[2] - Lichter, P., Cremer, T., Borden, J., Manuelidis, L. and Ward, D.C. Delineation of individual human chromosomes in metaphase and interphase cells by in situ suppression hybridization using chromosome specific library probes // Human Genetics.1988. V. 80. P. 224-234.
[3] - Florijn R.J., Bonden L.A., Vrolijk H., Wiegant J., Vaandrager J.W., Baas F., den Dunnen J.T., Tanke H.J., van Ommen G.J., Raap A.K. High-resolution DNA Fiber-FISH for genomic DNA mapping and colour bar-coding of large genes // Hum. Mol. Genet. – 1995. Vol. 4. – P. 831-836.
|
|
